疏水柱層析 | 水果好營養
疏水作用層析(HydrophobicInteractionChromatography,HIC)是根據分子表面疏水性[1]差別來分離蛋白質和多肽等生物大分子的一種較為常用的方法。蛋白質和多肽等生物大分子的表面常常暴露著一些疏水性基團,我們把這些疏水性基團稱為疏水補丁,疏水補丁可以與疏水性層析介質發生疏水性相互作用而結合。不同的分子由於疏水性不同,它們與疏水性層析介質之間的疏水性作用力強弱不同,疏水作用層析[2]就是依據這一原理分離純化蛋白質和多肽等生物大分子的。
操作特點疏水層析[3]的基本操作與其他層析大致相同。所要注意的事項有以下方面:
1、層析柱的製備 進行疏水層析時,所使用層析柱之規格包括柱體積大小、直徑粗細、柱高度(h)與其直徑(d)的比值等,均與普通層析的相似。在分離樣品量較大時,宜選用體積較大的層析柱,h:d的比值應≤3。
2、平衡 疏水層析柱裝柱完畢後,通常要用含有高鹽濃度(如1mol/L (NH4)2SO4或2mol/L NaCl)的緩衝液進行平衡。
3、加樣與洗脫[4] 加樣前,在樣品溶液中要補加適量的鹽類。通常加1mol/L (NH4)2SO4或2mol/LNaCl,以使樣品中的生物大分子局部變性,並能與固定相很好地相互吸附。加鹽的樣品溶液要混勻,放置片刻後即可上柱,當把此樣品溶液徐徐加入固定相(使生物大分子與固定相之間作用0.5~1h)後,先用平衡緩衝液洗滌,再用降低鹽濃度的平衡緩衝液洗脫。
4、再生 洗脫後的層析柱欲重複使用時,需對其固定相進行再生處理,即用8mol/L尿素[5]溶液或含8mol/L尿素的緩衝溶液洗滌層析柱(以除去固定相吸附的雜質),接著用平衡緩衝液平衡。採用此程式處理過的疏水層析柱,可重複使用。
特點與套用1、疏水柱層析特點:(1)疏水柱層析可直接分離鹽析後或高鹽洗脫下來的蛋白質、酶等生物大分子溶液;(2)解析度很高、流速快、加樣量大;(3)疏水性吸附劑種類多,選擇餘地大,價格與離子交換劑相當...
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