考马斯亮蓝法(bradford)测蛋白浓度原理步骤注意事项 | 水果好營養
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考马斯亮蓝染色法,也称Bradford检测法,是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法。其最早是在1976年由Bradford根据蛋白质与染料相结合的原理建立。
1.Bradford法原理
在酸性分析试剂溶液中,染料考马斯亮蓝 G-250与蛋白质结合的主要是阴离子形式的蓝色,其最大吸收峰 (λmax)位置在590nm,形成的复合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系。因此,通过测定染料的蓝色离子态可以定量测定蛋白质,通常测定595nm下的吸光度
研究认为染料最容易与蛋白质中的精氨酰和赖氨酰残基结合,由于各种蛋白质中的含量不同,与染料的相互作用有强有弱,导致测定不同蛋白质时偏差较大。进行了一些改良后,可以克服波动问题,但通常会导致检测更容易受其他化合物的干扰。
2.Bradford法优缺点分析
优点 缺点 ①.方便简单快速; ②.灵敏度高。 ③.受生物制品中的非蛋白质组分和常用试剂的干扰更少。 ①.易受强碱性缓冲液、TritonX-100、SDS等去污剂的影响。 ②.标准曲线有轻微的非线性。 ③.不同蛋白质测定时有较大的偏差。3.Bradford法实验流程
(1)染料试剂 100mg考 马 斯 亮 蓝 G-250溶 解 在50ml 95%乙 醇,然 后 与100ml 85%磷酸混合,加入蒸馏水配成1L。棕色瓶中室温下可储存数周,使用前必须用滤纸过滤除去储存试剂中沉淀的染料。在常规蛋白测定中,对染料的品质无严格要求,考马斯亮蓝 G-250中可溶性染料的含量因来源和供应商不同变动很大,通常认为Serva蓝G 含量最高,往...
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