蛋白纯化His | 水果好營養
2018年12月7日—His-tag是蛋白质重组技术中经常用到的一种标签,其序列为6个组氨酸HHHHHH,其特点是分子量小,只有不到0.84KD,基本不改变蛋白质的生物结构,不改变 ...
1、什么是His-tag?
His-tag单抗[1]又叫6*His-tag单抗,或6*His单克隆抗体,用小鼠制备,His可被镍柱吸附,用于纯化重组蛋白,无论表达的蛋白是可溶的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和层析(IMAC)纯化。金属螯合亲合层析,又称固定化金属离子亲合层析[2](Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC),是近30年发展起来的一种新型分离技术。最早由Paroth等人提出。该方法利用蛋白质表面的一些氨基酸,如组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等能和金属离子发生特殊的相互作用的原理,从而对蛋白质加以分离。这些作用包括配价键结合、静电吸附、共价键结合,其中以配价键结合为主,而且这其中又以6组氨酸标签(His-Tag)应用最为广泛。His-tag是蛋白质重组技术中经常用到的一种标签,其序列为6个组氨酸HHHHHH,其特点是分子量小,只有不到0.84 KD,基本不改变蛋白质的生物结构,不改变蛋白质的溶解性,更重要的是它使蛋白质的纯化变得极为方便。根据组氨酸上的咪唑环可以与二价金属离子结合的原理,His-Tag 可结合在目的蛋白的 C 末端或 N 末端,形成特殊的结构,以便于进行下一步的纯化及检测。人们可以利用金属离子亲和层析技术纯化带有His标签的蛋白,即将含有目的蛋白的裂解液通过固定的二价金属离子(通常是二价Ni离子)填料,带有6*his-tag[3]的蛋白质即与填料结合,其它蛋白不与填料结合,最后再用高浓度的咪唑即可将目的蛋白洗脱下来。
以实验小鼠为宿主制备的His-tag单抗叫His-tag鼠单抗。其制备方法通常是这样的:人工合成6*His多肽,即氨基酸序列为HHHHHH的多肽,必要时在末端添加偶联载体用到的特殊氨基酸。合成好此多肽后,通过化学方法将此多肽与载体蛋白偶联(如KLH、BSA、OVA等),偶联完成后,再用偶联好的全抗原免疫实验小鼠,免疫结束后杀死免疫好的小鼠,无菌条件下取脾脏,与骨髓瘤细胞进行融合,用ELISA或者其它手段进行筛选出阳性的克隆,筛选到的细胞经过克隆化后即形成稳定的细胞株,将此细胞株进行体外培养或小...
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